制備型反相高效液相色譜 (HPLC) 可分離高純度化合物,被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、制藥、生物技術(shù)和生物化學(xué)行業(yè)。由于其分離純度高,在小分子藥物化合物、寡核苷酸、多肽、天然產(chǎn)物的藥物合成中成為必不可少的純化手段。
圖1:HPLC純化在藥物中的案例
HPLC餾分是什么?
HPLC餾分是含有水和極性有機(jī)溶劑(如乙腈/水或甲醇/水),為了更好的分離雜質(zhì),反向HPLC流動(dòng)相中通常會(huì)添加0.1%三氟乙酸(TFA)。
1、HPLC餾分濃縮面臨的問題
藥物發(fā)現(xiàn)中,為了建立文庫或通過高通量篩選確定合適的靶標(biāo),藥物合成后需要進(jìn)行大量純化、篩選、分析工作,每天需要處理大量的HPLC餾分,前處理所花費(fèi)的時(shí)間高達(dá)61%。
處理HPLC餾分濃縮時(shí)可能出現(xiàn)的瓶頸:
1. 藥物種類多變,樣品體積、樣品容器、溶劑比例不一;
2. 樣品量巨大,處理時(shí)間長(zhǎng);
3. 甲醇/乙腈的沸點(diǎn)較低,在蒸發(fā)過程容易產(chǎn)生暴沸;
4. 直接濃縮干燥很難得到干燥蓬松的最終產(chǎn)物。
2、提升效率的關(guān)鍵點(diǎn)
新藥研發(fā)就是與時(shí)間賽跑,提高效率就是節(jié)省金錢。
因此,提高樣品平行濃縮的效率,就必須解決樣品前處理中高通量和自動(dòng)化的問題,在藥物發(fā)現(xiàn)CRO企業(yè)中尤為重要。
高通量
為滿足藥物高通量篩選要求,Genevac HT-12高端智能的蒸發(fā)系統(tǒng)提供高通量處理量,同時(shí)處理上百個(gè)到上千個(gè)樣品,上百種轉(zhuǎn)子可選,滿足各類化合物體積不一和高通量的濃縮需求。
轉(zhuǎn)子類型 |
HT-12 樣品通量 |
EZ-2 4.0 樣品通量 |
深孔板 |
24*96 |
4*96 |
淺孔板 |
48*96 |
8*96 |
50ml燒瓶 |
48 |
8 |
50ml離心管 |
120 |
20 |
4ml小瓶 |
288 |
48 |
16×100mm 試管 |
288 |
48 |
13×100mm 試管 |
480 |
80 |
1.5mlEP管 |
384 |
64 |
樣品完整性
現(xiàn)代藥物化學(xué)中,保持樣品的質(zhì)量和完整性非常重要。Dri-pure防暴沸技術(shù),利用梯度真空和高轉(zhuǎn)速的原理,有效防止低沸點(diǎn)溶劑暴沸,避免樣品交叉污染。(點(diǎn)擊查看往期內(nèi)容:實(shí)力解析:如何防止混合溶劑“碰撞”導(dǎo)致的樣品損失)
自動(dòng)化
以下是實(shí)驗(yàn)室一般處理流程及Genevac的處理流程的對(duì)比圖——
Genevac通過SampleGenie技術(shù)簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)流程,直接將樣品濃縮到小瓶中,避免樣品轉(zhuǎn)移帶來的損失,并可以節(jié)約濃縮時(shí)間,以方便后續(xù)處理。
圖2:實(shí)驗(yàn)室一般處理流程
圖3:Genevac處理流程簡(jiǎn)化方案
3、如何從HPLC餾分中高效得到干燥蓬松的最終產(chǎn)物?
藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)室的要求是將樣品干燥成蓬松的粉末狀,以便準(zhǔn)確稱量樣品、二次取樣、復(fù)溶和儲(chǔ)存,因此,冷凍干燥是實(shí)驗(yàn)的理想技術(shù)。但是常規(guī)的冷凍干燥系統(tǒng)一方面處理時(shí)間長(zhǎng),另一方面難以處理有機(jī)溶劑,因?yàn)橛袡C(jī)溶劑很容易產(chǎn)生暴沸,并因此損壞真空泵,造成樣品損失。而使用傳統(tǒng)的蒸發(fā)技術(shù)難以得到蓬松的樣品。
LyoSpeed?技術(shù)
快速凍干法(LyoSpeed?)是一個(gè)兩全其美的方法:一種快速,能夠得到徹底干燥和蓬松樣品的方法。該方法同時(shí)也適用于難以干燥的樣品,尤其適用HPLC餾分干燥。利用先濃縮后凍干的程序,蒸發(fā)程序包含以下階段:
1) 使用Dri-pure防暴沸技術(shù)& 40mbar的壓力下去除部分大部分有機(jī)溶劑;
2) 自動(dòng)排液放出有機(jī)溶劑(ADD冷阱自動(dòng)排液功能);
3) 真空度降至8mbar,快速蒸發(fā)大部分水;
4) 關(guān)閉紅外燈,極低的真空度下使樣品冷凍變成固態(tài);
5) 在全真空下加熱一定時(shí)間以加速升華;
6) 最后在全真空不加熱的條件下直至樣品完全冷凍干燥。
圖4:快速凍干過程
Lyospeed法比只用凍干的方法速度更快,同時(shí)比只用蒸發(fā)的方法得到更加干燥和蓬松的樣品。
4、案例分享
將15ml 0.01M 布洛芬鈉鹽溶液溶解在40%乙腈水混合物中并裝入20ml閃爍瓶,使用Lyospeed技術(shù)平衡濃縮和凍干過程,在HT系列溶劑蒸發(fā)工作站進(jìn)行快速凍干。下圖顯示傳統(tǒng)離心濃縮樣品與快速凍干樣品之間的差異,快速凍干的樣品更加蓬松,更利于樣品的復(fù)溶。
圖5:傳統(tǒng)蒸發(fā)結(jié)果
圖6:快速凍干結(jié)果
Lyospeed技術(shù)兼容EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng)和Genevac HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站,由足夠好的無油真空泵、自動(dòng)除霜和排液的冷阱以及一個(gè)靈活、可編輯方法的軟件組成。
EZ-2 4.0 Elite離心濃縮系統(tǒng)
HT 3i系列溶劑蒸發(fā)工作站
參考文獻(xiàn):
Genecac_TechArticle_Drying of Problematic Purification Samples by Lyophilisation in a Centrifugal Evaporator - with “Fluffy” Results