眾所周知,隨著寡核苷酸的應(yīng)用越來越廣泛,不少企業(yè)相繼加入寡核苷酸合成的賽道。想得到優(yōu)質(zhì)高純度的核酸不是一件簡單的事,寡核苷酸的合成通常會導(dǎo)致不可避免的雜質(zhì)積累,它們可能會與全長產(chǎn)品競爭,或者抑制反應(yīng),因此選擇高效率高質(zhì)量的純化和干燥工藝是很有必要的。那么對于工業(yè)級別的寡核苷酸純化,一般又有哪些方法呢?且聽小編跟您慢慢分享。
寡核苷酸的應(yīng)用
Oligo即寡核苷酸鏈,分子實(shí)驗(yàn)室常用的PCR引物、NGS捕獲探針、qPCR探針和FISH探針等都是寡核苷酸。除了引物探針以外,還可作為核酸藥物用于遺傳疾病、腫瘤、病毒感染和感覺器官等疾病的治療或預(yù)防。
探針及引物主要用于IVD試劑盒,面對需求量巨大的檢測試劑盒,上游原材料的質(zhì)量和供應(yīng)速度應(yīng)該同幅度進(jìn)步和增長,在引物和探針的制備過程中,提高生產(chǎn)效率以及產(chǎn)物純度更是重中之重。
純化方式
對于不同的寡核苷酸鏈,應(yīng)該如何選擇合適的純化方法?下面列舉了幾種常見的純化方法。
DSL(脫鹽)純化
利用反相 C-18 層析柱進(jìn)行脫鹽,它對 DNA 有特異性的吸附,一些雜質(zhì),如氨、鹽,不能被吸附,所以能有效地去除鹽分等雜質(zhì)。該方法不能有效去除比目的DNA短的小片段,所以適用于要求較低的PCR普通引物。
圖1:DSL純化制備流程圖
OPC純化
根據(jù) DNA 保護(hù)基( DMTr 基)和 Cartridge 柱中樹脂間的親合力作用的原理進(jìn)行純化目的 DNA 片段。該方法得到目的DNA的純度能達(dá)到 95%以上,但受柱容量影響,適用于 40mer 以下的普通引物。
圖2:OPC純化制備流程圖
PAGE純化聚彬稀酰胺凝膠電泳
使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,對引物DNA進(jìn)行分離,然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法,純化后的DNA純度大于90%,對長鏈 (大于50mer)普通引物的純化特別有效。
圖3:PAGE純化制備流程圖
HPLC高效液相色譜法
根據(jù)寡核苷酸的疏水性對DNA片段進(jìn)行純化分離,該方法能達(dá)到極高的純度和靈敏度,可以有效去除N-1短片段,目標(biāo)DHA的純度大于95%。適用于對純度要求高的短鏈(小于40 mer)普通引物、修飾引物,尤其適合及熒光標(biāo)記探針的純化。
若想得到純度極高的寡核苷酸片段,HPLC法也常被用于與其他方式雙重聯(lián)合(如HPLC_PAGE、HPLC_CE、2xHPLC等)。
圖4:HPLC純化制備流程圖
引物干燥過程中的質(zhì)量控制考慮
引物合成純化后都會產(chǎn)生一定的有機(jī)溶劑(如乙腈、甲醇、水等),需要采用真空離心濃縮設(shè)備將寡核苷酸干燥成干粉狀,一般包裝至EP管或者96孔板中。
圖5:引物生產(chǎn)流程
作為分子診斷qPCR試劑盒中的核心原料,qPCR引物及Taqman探針的質(zhì)量直接影響了靶標(biāo)檢測的準(zhǔn)確性,所以選擇干燥工藝也十分關(guān)鍵,在干燥過程的質(zhì)量控制需盡考慮以下幾個方面:
樣品保護(hù)和溫度控制
在寡核苷酸的干燥過程中,盡量避免加熱源直接照射在樣品上而導(dǎo)致樣品局部過熱。紅外加熱模式,不直接加熱樣品,這樣確保了樣品的溫度不會高于樣品支架的溫度,保證了樣品的安全。SampleShield溫度控制系統(tǒng),采用非接觸式溫度探測用以在整個離心過程中,檢測樣品和離心腔的溫度變化,確保整個蒸發(fā)過程受到質(zhì)控。
避免交叉污染
由于溶劑蒸發(fā)的過程中,低沸點(diǎn)溶劑和混合溶劑容易產(chǎn)生暴沸而導(dǎo)致樣品損失和交叉污染,這會直接影響樣品純度。Dri-Pure防爆沸技術(shù),控制真空度下降梯度和施加500g的離心力,讓用戶處理96孔板或384孔板等密集型容器時,無需擔(dān)心樣品交叉污染。
高通量
選用通量高、干燥效率快的干燥手段對寡核苷酸的制備過程事半功倍,GeneVac濃縮儀可批量處理樣品:一次可以處理幾百個甚至上千個樣品,全系列產(chǎn)品都有專門適配EP管和96孔板的鋁制實(shí)心轉(zhuǎn)子。如HT-12一次可以濃縮384個1.5ml EP管或24塊96孔板,大大提高了研發(fā)和生產(chǎn)效率。
自動停機(jī)
在制備大量的寡核苷酸樣品時,無需值守的自動停機(jī)功能派上用場,使寡核苷酸樣品干燥后立即自動停止蒸發(fā),為核酸樣品提供雙重保護(hù)機(jī)制。
應(yīng)用案例
WTCHG(牛津大學(xué)人類遺傳學(xué)威康信托中心) 使用Sequenom MassARRAY®SNP 基因分型系統(tǒng)用于SNP分析,樣品前制備過程分別使用風(fēng)干(左)和Genevac?EZ-2真空離心濃縮儀(右)干燥含有寡核苷酸樣品的384孔板。
下圖結(jié)果表明,使用EZ-2真空離心濃縮儀干燥寡核苷酸樣品,可以大大降低樣品降解率,保證樣品不會被污染,消除了樣品損壞的潛在來源。
圖6:在空氣干燥(左)和EZ-2蒸發(fā)器干燥(右)后的序列樣品質(zhì)量分析
*深綠色-高樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量
*淺綠色-中等樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量
*紅色-樣品質(zhì)量差或無數(shù)據(jù)
圖7:空氣干燥(左)和EZ-2蒸發(fā)器干燥(右)后的SNP分析
Genevac真空離心濃縮儀
離心濃縮作為IVD原料合成制備的關(guān)鍵技術(shù)之一,具有通量高、干燥效率高、保護(hù)樣品等特點(diǎn),真空離心使?jié)饪s過程都保持在較溫和的環(huán)境中,提高寡核苷酸的產(chǎn)品純度與收率,在工藝選擇開發(fā)和放大中建立良好的工藝空間。
一臺高通量真空離心濃縮儀就可以做到濃縮干燥一步到位,可以直接作為生產(chǎn)設(shè)備投入到生產(chǎn)中,縮短整個Oligo制備過程,例如上述實(shí)驗(yàn)中所提到的Genevac?EZ-2真空離心濃縮儀。這邊我們?yōu)榇蠹彝扑]下面幾款Genevac旗下的真空離心濃縮儀。