黃曲霉毒素分析-HPLC檢測對比實(shí)驗(yàn)

一、介紹

黃曲霉毒素是由生活在熱帶或亞熱帶地區(qū)的黃曲霉，寄生曲霉和曲霉等微生物產(chǎn)生的一組霉菌毒素，具有強(qiáng)烈的致癌作用。據(jù)報(bào)道，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素含量較高，超過食品安全機(jī)構(gòu)（如FDA）在各種食品（包括水果，豆類，谷物和香料）中規(guī)定的安全水平。

目前的法規(guī)要求總黃曲霉毒素（黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的總和）必須低于10μg/ kg。本次實(shí)驗(yàn)使用三氟乙酸（TFA）與HPLC結(jié)合熒光檢測的柱后衍生法進(jìn)行黃曲霉毒素分析。該方案可大大提高檢測黃曲霉毒素B1和G1的靈敏度。度除衍生方法外，多功能柱或免疫親和柱的使用可用于提高樣品制備過程中的再現(xiàn)性和回收率。

二、試驗(yàn)

●   常規(guī)HPLC

●   UHPLC

●   結(jié)構(gòu)體

黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2是產(chǎn)生天然熒光的化合物。然而，B1和G1的熒光強(qiáng)度與B2和G2的熒光強(qiáng)度相比要小得多，因此，必須通過使用TFA衍生化從天然形式轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基化形式來提高黃曲霉毒素B1和G1分析的靈敏度。黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的結(jié)構(gòu)以及衍生的B1和G1的結(jié)構(gòu)如圖所示：

圖1.黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2和TFA衍生的B1和G1的結(jié)構(gòu)

●   Derivatizaton

黃曲霉毒素和實(shí)際樣品的標(biāo)準(zhǔn)混合物的TFA衍生化程序如圖所示：

圖2. TFA衍生化
* 1為了避免黃曲霉毒素吸附到容器內(nèi)壁上，必須用乙腈和Milli-Q水沖洗容器，然后干燥。

●   樣品制備

選擇玉米粗粉和烤花生作為測試樣品，并使用多功能柱用于玉米粗粒的樣品制備，而免疫親和柱用于制備烤花生。樣品制備程序如圖3所示。

1.玉米糠

2.烤花生

* 1在恢復(fù)估計(jì)試驗(yàn)中，將使用在重鉻酸鹽/ Milli-Q水（90/10）中的黃曲霉毒素（各自為0.5 11g / L）的標(biāo)準(zhǔn)混合物。
* 2多功能柱中有三種分離模式（反相，正相和離子交換）。（RomerLabs）
* 3免疫親和柱（HORIBA）利用抗黃曲霉毒素單克隆抗體和黃曲霉毒素之間的獨(dú)特結(jié)合能力。
* 4讓色譜柱平衡至室溫。小心地在上蓋上的孔上打孔，使空氣不會進(jìn)入凝膠，然后取上蓋和下蓋。
* 5用0.20克氯化鉀，0.20克磷酸二氫鉀，1.16克磷酸氫二鈉和8.0克氯化鈉（pH7.4）至1升配制Milli-Q水溶液。
* 6小心沖洗色譜柱，使空氣不會進(jìn)入凝膠。
* 7最大限度地減少乙腈中最終洗脫液的含水量。如果最終洗脫中的水含量相對較高，則消除溶劑需要更長的時(shí)間，這可能導(dǎo)致黃曲霉毒素的變性。
* 8完全從凝膠中釋放相互作用的黃曲霉毒素。

三、結(jié)果

黃曲霉毒素分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：TFA衍生的黃曲霉毒素（各自為5.0μg/ L）的標(biāo)準(zhǔn)混合物的色譜圖如圖4所示[通過常規(guī)HPLC（上部），通過UHPLC（下部）]。通過常規(guī)HPLC在12分鐘內(nèi)完成分離，并在3.5分鐘內(nèi)通過UHPLC完成分離。

黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)混合物的線性范圍為0.5至10μg/ L，常規(guī)HPLC和UHPLC均具有優(yōu)異的相關(guān)性r2。

對于常規(guī)HPLC，在峰值保留時(shí)間和面積上分別具有優(yōu)于0.2％RSD和3％RSD的良好再現(xiàn)性，包括TFA衍生化程序（N = 6）。UHPLC還具有良好的重現(xiàn)性，峰值保留時(shí)間和面積分別具有優(yōu)于0.2％的RSD和3.5％的RSD。將1.0ug / L的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物用于該估計(jì)。

圖4.黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物的色譜圖（每種5.0μg/ L，TFA衍生化）1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

使用樣品制備中的多功能柱（MycoSep 226AflaZon +）制備的玉米粗粒樣品的色譜圖顯示在圖5中（常規(guī)HPLC和UHPLC）。來自玉米粗粒的樣品和摻有黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復(fù)估計(jì)。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰，并且對于常規(guī)HPLC和UHPLC都獲得了標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的良好回收率，分析結(jié)果如表1所示。

在樣品制備中使用免疫親和柱（AFLAKING）制備的烤花生樣品的色譜圖顯示在圖6中（常規(guī)HPLC和UHPLC）。來自烤花生的樣品和摻有黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)混合物的樣品用于黃曲霉毒素的恢復(fù)估計(jì)。在色譜圖中幾乎沒有觀察到污染物峰，并且對于常規(guī)HPLC和UHPLC都獲得了標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的良好回收率，分析結(jié)果如表2所示。

圖5.來自玉米粒的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

圖6.來自烤花生的純化溶液的色譜圖1 =黃曲霉毒素G1,2 =黃曲霉毒素B1,3 =黃曲霉毒素G2,4 =黃曲霉毒素B2

表1.標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素的回收率[％]