凍干法通常是優(yōu)先選擇的樣品干燥方法,因為它能在低殘留溶劑水平的情況下實現(xiàn)高水平的干燥。此外,樣品的輕質(zhì)、粉狀、"蓬松"的表面處理使樣品易于取出和稱量。然而,凍干法也存在許多局限性。
在本文介紹的這項研究中,我們將展示Genevac如何通過將工藝轉(zhuǎn)移到溶劑蒸發(fā)工作站中來改變優(yōu)化方法,并實現(xiàn)純化實驗室想要的結(jié)果。
研究介紹
多年來,凍干或冷凍干燥一直用于在實驗室中干燥樣品。該技術(shù)經(jīng)過深入研究,已成為許多需要干燥少量樣品的研究人員的優(yōu)先選擇方法。
然而,傳統(tǒng)的冷凍干燥設(shè)備存在許多潛在的缺點,包括:
● 須在有限范圍的溶劑中制備樣品,通常只能使用水;
● 不能使用揮發(fā)性有機溶劑及其混合物;
● 干燥周期過長,能耗成本高。
通常,有許多樣本和多種溶劑處理的研究人員(比如來自含有水和乙腈的制備性反相高效液相色譜分離),已經(jīng)開始使用離心濃縮儀。而在其他實驗室中,例如,有機溶劑的侵蝕性使得凍干機不適用,這時普通的離心濃縮將存在很大的局限性。
純化問題
純化實驗室接收到含有水和已腈的樣品,通常會含有0.1%TFA的改性劑。采用凍干法去除這些溶劑存在著以下幾個困難:
● 乙腈需要非常低的真空來凍結(jié)它,或者需要一個能夠主動凍結(jié)樣品的凍干機。乙腈在-65°C時凍結(jié)。如果它沒有被凍結(jié),那么很可能會發(fā)生暴沸,這將導(dǎo)致樣品損失和交叉污染;
● 其次,冷凝器中的乙腈會破壞真空,后續(xù)幾乎不可能對水進行冷凍干燥;
● 這種緩慢的凍干過程與生產(chǎn)希望縮短的工藝時間不兼容。而Genevac溶劑蒸發(fā)工作站可以快速并行地干燥許多不同的樣品,而不會發(fā)生暴沸。
另外,用戶報告說明在一批樣品中干燥時遇到了一些困難。例如,三氟乙酸(TFA)的殘留問題;存儲時損壞樣品的問題;并且該化合物可能會與水發(fā)生相互作用使得化合物的沸點提高。殘留溶劑會在核磁共振分析中顯示出來。雖然以上問題偶爾會發(fā)生,但手動挑選一些處理不全的樣品,對于自動化實驗室來說是不可接受的;因此整個批次樣品都需要重新處理。
新工藝:在離心蒸發(fā)器中凍干
在水中制備的樣品可以在離心蒸發(fā)器中通過抽取最佳可用真空進行凍干,在配備耐溶劑渦旋泵的極限真空低于0.5mbar;足以凍結(jié)水。這就像冷凍干燥一樣緩慢。
Genevac開發(fā)了一種新工藝,用戶可以利用離心蒸發(fā)器的速度蒸發(fā)一些溶劑,然后在只剩下幾毫升溶劑時切換到凍干模式。處理96x30ml級分所需的處理時間從冷凍干燥機中的48小時到Genevac HT-12中的16小時(過夜),相當于每個30ml樣品順序處理僅需10分鐘。
圖1:Genevac HT-12溶劑蒸發(fā)工作站
水和乙腈的凍干
我們將0.01M布洛芬鈉鹽的水溶液儲備液用作標準樣品。將15ml溶液裝入48個20ml樣品瓶中,并在各種條件下置于 Genevac HT-12蒸發(fā)器中進行干燥。
圖2:Genevac 20ml小瓶轉(zhuǎn)子
實際的蒸發(fā)方法通常包括多達四個階段:
1. 使用快速蒸發(fā)濃縮大部分溶劑;
2. 冷卻樣品和樣品架,準備;
3. 使用深真空冷凍樣品;
4. 凍干殘留溶劑,加熱或不加熱;
以上的步驟關(guān)鍵在于如何把水凍住和干燥。
我們重點關(guān)注如何把已腈全去除考慮了進去,這個階段將分為三個步驟,以在濃縮水之前去除乙腈:
1. Dri-Pure®—真空斜坡和高轉(zhuǎn)子速度防止爆沸;
2. 濃縮—在40mbar 的真空度下去除乙腈而不凍結(jié)水(此處乙腈在+2°C沸騰);
3. 排空冷凝器—因為殘留的乙腈會破壞后期階段的真空。
不同干燥方式的最終樣品形態(tài)對比
我們在60:40的水和乙腈混合物中制備0.01M布洛芬鈉鹽溶液。試驗表明不需要冷卻階段。通過調(diào)整以實現(xiàn)濃縮和凍干的正確平衡。48x15ml樣品在5小時內(nèi)干燥,相當于連續(xù)干燥6.25分鐘。下圖顯示了凍干結(jié)果與傳統(tǒng)離心蒸發(fā)樣品之間的差異。差異很明顯,凍干樣品的再溶解更容易,而干燥的樣品不容易全部溶解。
A –過度干燥= 傳統(tǒng)蒸發(fā)結(jié)果
B—凍干結(jié)果
結(jié)論
樣品的凍干提高了干燥后樣品的溶解度。在凍干階段加入熱量大大減少了凍干時間。當凍干水和乙腈混合餾分時,Genevac HT系統(tǒng)集成了自動除霜和排水功能,提高了整個流程的自動化程度,無需人為干預(yù)。
應(yīng)用案例一:榮譽制藥
從難以干燥的HPLC純化餾分中制備可稱量樣品
通常在純化后,樣品都會被干燥,然后用少量的溶劑重新溶解后分到一個(?。悠啡萜髦写鎯ΑMǔ_@些會被用作分析方法,如干重測定產(chǎn)量和NMR分析的子抽樣。KuDOS制藥公司的科學家遇到了在純化后樣品干燥困難的問題。對于KuDOS,典型的頑固樣品會形成膠狀物或油狀物,從而造成處理問題,包括:
● 未完全干燥的樣品導(dǎo)致無法確定真實重量;
● 殘留溶劑促進更快的化合物降解。
解決方案
KuDOS/阿斯利康聯(lián)合開發(fā)了一種新的樣品干燥方法,它克服了殘留溶劑和餾分匯集的問題。
處理和合并流程
1. 將干燥的部分重新溶解在最少的水和甲醇中;
2. 將級分匯集到20ml閃爍瓶中并干燥;
3. 樣品溶解在極少量的 1,4-二惡烷中:一些頑固的樣品以樹膠或油的形式存在;
4. 將餾分匯集到帶有條形碼的去皮小瓶中;
5. 小瓶放置在樣品架中用于蒸發(fā),并冷凍在–20°C的冰箱中;
6. 使用Genevac HT-12蒸發(fā)器在完全真空下凍干小瓶,通常過夜。
結(jié)果適用于>90% 以前難以處理的樣品,可以得到易碎的“蓬松”固體,可以輕松處理并完全干燥。對于少數(shù)在1,4-二氧六環(huán)中溶解不好的樣品,已經(jīng)成功使用了兩種方法:
1. 將樣品重新溶解在少量甲醇(2-3ml)中,然后加入水(約10ml),樣品在Genevac HT中使用真空梯度干燥(Dri-Pure ) 以防止碰撞加上完全真空以凍結(jié)水;
2. 將樣品重新溶解在少量叔丁醇中(在+25°C下冷凍,非常適合凍干),然后在全真空下干燥。
結(jié)果:“蓬松”固體或結(jié)晶樣品(干燥且可稱重)
應(yīng)用案例二:諾華生物醫(yī)學研究所
在凍干過程中保護樣品免受交叉污染的簡單方法
NIBMR報告生產(chǎn)了完全凍干的“蓬松”樣品,沒有殘留溶劑,也沒有交叉污染。
方法
選擇以下氨基酸 L-Asn、L-Asp、L-Arg和一種大環(huán)內(nèi)酯xy作為凍干試驗的模型化合物。根據(jù)對樣品溶解度的研究知識,為樣品開發(fā)和選擇了以下范圍的溶劑混合物和體積:
● 1,4-二惡烷 – 2-3ml
● 叔丁醇 – 2-3ml
● 水 – 1-1.5ml
● 1,4-二惡烷和水 (1:1) – 約2ml
● 叔丁醇和水 (1:1) – 約2ml
使用1.0ml注射器測量溶劑體積。須使用足夠的溶劑才能實現(xiàn)良好的冷凍——樣品僅使用真空冷凍。樣品體積在真空下減半,樣品在二十分鐘后完全冷凍。
將樣品凍干在4ml小瓶中,小瓶固定在微孔板支架上,使樣品免受過多熱量的影響。
在有和沒有加熱階段的情況下進行試驗。兩種設(shè)置都產(chǎn)生了凍干樣品,但偶爾會看到一些粉末從試管中飄出并進入蒸發(fā)室。
防止交叉污染
通過限制通風口并用穿孔的石蠟?zāi)じ采w樣品,避免了可能被吹散的蓬松樣品的交叉污染。使用質(zhì)子NMR對樣品進行了測試,發(fā)現(xiàn)沒有殘留溶劑和交叉污染。取下薄膜時需要小心。交叉污染也可以通過應(yīng)用更高的g力來消除。
結(jié)論
仔細的樣品制備過程、高向心力的應(yīng)用和高真空生產(chǎn)的產(chǎn)品沒有交叉污染。
關(guān)于作者
KuDOS 案例作者:
1. Adrian Moore 是英國霍舍姆 KuDOS Pharmaceuticals 的分析小組組長;
2. Mandy Crowther 是英國奧爾德利公園阿斯利康公司的副首席科學家;
3. Rob Darrington 是英國伊普斯維奇 Genevac Ltd 的產(chǎn)品經(jīng)理。
諾華案例作者:
1. Klemens Hoegenauer 博士是奧地利維也納諾華生物醫(yī)學研究所的高級研究員;
2. Induka Abeysena 博士是英國伊普斯威奇 Genevac Ltd的應(yīng)用化學家。
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Genevac
英國Genevac是德祥集團資深合作伙伴之一。英國Genevac公司成立于1990年,隸屬SP Scientific旗下,一直專注于研究和生產(chǎn)各種離心蒸發(fā)濃縮設(shè)備,其產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于生命科學、制藥、化學、分析等領(lǐng)域。
德祥科技
德祥科技有限公司成立于1992年,總部位于中國香港特別行政區(qū),分別在越南、廣州、上海、北京設(shè)立分公司。主要服務(wù)于大中華區(qū)和亞太地區(qū)——在亞太地區(qū)有27個辦事處和銷售網(wǎng)點,5個維修中心和2個樣機實驗室。
30多年來,德祥一直深耕于科學儀器行業(yè),主營產(chǎn)品有實驗室分析儀器、工業(yè)檢測儀器及過程控制設(shè)備,致力于為新老客戶提供更完善的解決方案。公司業(yè)務(wù)包含儀器代理,維修售后,實驗室咨詢與規(guī)劃,CRO凍干工藝開發(fā)服務(wù)以及自主產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)、銷售、售后。與高校、科研院所、政府機構(gòu)、檢驗機構(gòu)及知名企業(yè)保持密切合作,服務(wù)客戶覆蓋制藥、醫(yī)療、商業(yè)實驗室、工業(yè)、環(huán)保、石化、食品飲料和電子等各個行業(yè)及領(lǐng)域。
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