自20世紀(jì)誕生以來，分子生物學(xué)迅速發(fā)展并在整個生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛滲透和應(yīng)用，推動了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)進(jìn)入基于分子層面實(shí)驗(yàn)科學(xué)的現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)時代。

核酸提取和純化是分子生物學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)，在以下應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中都需要進(jìn)行核酸提取：

● 分析基礎(chǔ)研究和疾病研究中的基因表達(dá)；

● 跟蹤對藥物治療的反應(yīng)(例如，在抗病毒治療期間和之后監(jiān)測病毒滴度）；

● 識別新物種并深入了解進(jìn)化過程 (例如，Ancient DNA分析）；

● 對人類、動物和植物中引起傳染病暴發(fā)的病原體進(jìn)行監(jiān)測和分類；

● 通過微生物檢測和量化監(jiān)測食品和水安全；

● 診斷疾病 (如基因疾病，癌癥，免疫學(xué)缺陷）。

核酸提取純化基本步驟

核酸純化方法是影響提取核酸質(zhì)量高低的最重要因素之一，也是下游分子生物學(xué)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，遵循提取純化原則以及選擇合適的純化、濃縮方法，可以使核酸的質(zhì)量及回收率達(dá)到最大化。

核酸提取純化原則和要求

● 需要保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性，為下游實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備；

● 排除其它核酸分子的污染（提取DNA時排除RNA的干擾，反之亦然）；

● 核酸樣品中沒有對酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和高濃度的金屬離子；

● 將核酸樣品中其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染降到最低程度。

核酸提取純化的常見方法

溶液抽提法

經(jīng)典的DNA提取方法：酚氯仿抽法，主要是使用兩種不同的有機(jī)溶劑交替抽提將蛋白去除。通過苯酚氯仿處理細(xì)胞破碎液或者組織勻漿后，在水相中主要溶解的是以DNA為主的核酸成分，在有機(jī)相中主要是多糖和脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸，之后再離心分離和溶解洗脫，而后通過將洗滌后的核酸沉淀進(jìn)行濃縮干燥即可得到高純度核酸。

離心柱法（柱膜法）

通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過。硅膠膜表面的硅醇基團(tuán)呈弱酸性，其水化后帶負(fù)電。當(dāng)溶液中存在一定濃度的陽離子后，形成的陽離子橋能夠中和DNA和硅醇基團(tuán)之間的表面負(fù)電荷，從而使DNA牢固地吸附在硅膠膜表面。反之，處于低鹽水溶液狀態(tài)下時，由于硅膠膜的硅醇基團(tuán)與DNA磷酸基團(tuán)之間的靜電排斥，硅膠膜釋放DNA。

利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。離心柱純化也是試劑盒提取中廣泛的使用方法。

磁珠法

運(yùn)用納米技術(shù)對超順磁性納米顆粒的表面進(jìn)行改良和表面修飾后，該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結(jié)合。磁珠法利用了磁性顆?；钚曰鶊F(tuán)在一定條件下可與核酸結(jié)合和解離的原理，先使用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，帶有活性基團(tuán)的磁性顆?？商禺愋晕綇募?xì)胞中游離出來的核酸分子，而樣品中的其他干擾物則很好的移除了，在磁場作用下，磁性顆粒與液體分開完成，最后回收顆粒（即磁珠-DNA 混合物），再用洗脫液洗脫，純化濃縮后即可得到純凈的DNA，獲得質(zhì)量較高的核酸模板。

提取純化方法的選擇

一般地，分離純化步驟越多，核酸的純度也越高，但得率會逐漸下降，完整性也愈難以保證。相反，通過分離純化步驟少的實(shí)驗(yàn)方案，我們可以得到比較多的完整性較好的核酸分子，但純度不一定很高。這需要結(jié)合核酸的用途而加以選擇。

如果對核酸提取的質(zhì)量要求不高，可以選擇經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的溶液法，選擇柱膜法還是磁珠法自動化提取，基本上取決于樣本數(shù)量，針對大批量的樣本，優(yōu)先選擇磁珠法自動化提取。如果對樣本數(shù)量較少，則可以選擇柱膜法，既快速又經(jīng)濟(jì)實(shí)用。對于Oligo寡核苷酸的純化，實(shí)驗(yàn)要求更高。（可參考往期推文）

不管采用哪一種核酸提取純化方法

都離不開濃縮干燥！

● 再濃縮核酸樣品，隨著核酸提取試劑的逐步加入，以及去除污染物過程中核酸分子不可避免的丟失，樣品中核酸的濃度會逐漸下降，甚至影響到后面的實(shí)驗(yàn)操作或不能滿足后繼研究與應(yīng)用的需要時，需要對核酸進(jìn)行濃縮，可將150uL DNA水溶液濃縮至10uL再進(jìn)行測序；

● 去除DNA樣品中醇的殘留，當(dāng)DNA樣品中有乙醇的殘留會影響測序反應(yīng)；

● 干燥DNA樣品。DNA沉淀后可能會含水或水/乙醇混合液，濃縮去除后可以得到干燥的DNA樣品。

常用的干燥方法：風(fēng)干VS真空離心濃縮儀應(yīng)用案例分享

WTCHG（牛津大學(xué)人類遺傳學(xué)威康信托中心) 使用Sequenom MassARRAY®SNP 基因分型系統(tǒng)用于SNP分析，樣品前制備過程分別使用風(fēng)干（左）和Genevac EZ-2真空離心濃縮儀（右）干燥含有寡核苷酸樣品的384孔板。

下圖結(jié)果表明，使用EZ-2真空離心濃縮儀干燥寡核苷酸樣品，可以大大降低樣品降解率，保證樣品不會被污染，消除了樣品損壞的潛在來源。

深綠色-高樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量

淺綠色-中等樣本數(shù)據(jù)質(zhì)量

紅色-樣品質(zhì)量差或無數(shù)據(jù)

使用真空離心濃縮儀，可以避免核酸濃縮干燥遇到的過度加熱、絕對干燥、交叉污染及紫外損害保證核酸樣品的完整性。

Genevac真空離心濃縮儀

濃縮干燥DNA樣本，Genevac真空離心濃縮儀是合適的選擇，Genevac系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于DNA樣品制備與純化處理，不論是處理PCR前的簡單的小體積濃度DNA pellets，還是高通量處理許多純化DNA或寡核苷酸的樣品，都有不同的機(jī)型可供選擇。

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