隨著生物制藥的迅猛發(fā)展，凍干已經成為一種有效的技術來解決制藥過程中存在的化學，物理，生物的不穩(wěn)定性問題。結合凍干本身的技術特點，凍干產品開發(fā)的目的是要保證產品質量的同時利用更短的生產時間來節(jié)約成本。產品的質量包括安全，高效，穩(wěn)定，較短的復水時間，優(yōu)雅的蛋糕外觀等。

眾所周知，凍干是一個復雜的傳熱傳質的過程，如果處理不當，在冷凍以及干燥過程中，樣品中的活性成分以及賦形劑會發(fā)生一些物理或化學變化，從而破壞了各自原有的功能特性，因此需要進行采取合理的方法來加以解決，從而達到凍干制劑開發(fā)的目的。

 預凍階段 

樣品溶液隨著溫度的降低，含有的水先凍結成冰晶析出，剩余的溶液的濃度越來越大，形成最大濃縮凍結液，溶質和溶劑分離，在這個階段，水分的結晶會導致蛋白濃度增加，賦形劑濃度增加，離子強度增加，粘度增加，賦形劑結晶或相分離，pH改變等，這些可能會影響到蛋白的穩(wěn)定性。

 干燥 

結晶的冰通過升華去除，未結晶的冰通過解吸附去除，樣品中的水分含量是一個動態(tài)變化的過程，樣品會面臨水分去除產生的應力，即干燥應力，導致配方中成分發(fā)生一定的變化。

 儲存 

較低的水分含量，溫度的偏差，賦形劑的相分離。

常用賦形劑的功能性及物理狀態(tài)

表1：常用賦形劑的功能性及期望的物理狀態(tài)

然而在凍干過程中，活性成分以及賦形劑之間具有復雜的相互影響，不同的濃度，不同的比例，不同的種類等都會引起一些結構狀態(tài)的變化，從而導致其原本的功能喪失，比如：若海藻糖結晶會導致保護功能的喪失；若甘露醇變?yōu)闊o定形結構，會降低產品的關鍵溫度，并且無定形態(tài)具有較差的穩(wěn)定性，喪失了其作為填充劑的功能；若緩沖液成分結晶，會導致pH值的變化，緩沖功能喪失，蛋白穩(wěn)定性受到影響。因此研究各個配方組分之間的相互影響作用對確保最終產品的質量具有較大的作用。

 01.糖類和填充劑功能性之間的相互影響 

雙糖是常用的凍干保護劑，如蔗糖，海藻糖，雙糖與蛋白的最小質量比通常為3:1到5:1，但是糖類通常會降低樣品的玻璃態(tài)轉化溫度，使得凍干通常會花費較長的時間，因此會將糖類跟具有較高共晶融化溫度的填充劑結合使用，如甘露醇，甘氨酸，這樣可以讓樣品在較高的溫度下進行干燥，形成良好的外觀結構，節(jié)約干燥時間(Tang and Pikal, Pharm Res. 2004; Johnson, Kirchhoff and Gaud, J Pharm Sci. 2001)。

市面上有一些藥品就是以這種方式開發(fā)的，如阿必魯泰（Tanzeum），是一種融合蛋白，糖尿病患者用藥，配方中含海藻糖以及甘露醇成分；沙格司亭凍干粉注射劑（Leukine）是一種源于酵母的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（rhGM-CSF），能夠刺激各種免疫細胞的生長和活化，已用于白血病患者降低感染風險，配方中含蔗糖和甘露醇成分；魯磨西替（Lumoxiti）是一種單抗抗癌制劑，配方中含蔗糖和甘氨酸成分。

圖1：阿必魯泰（Tanzeum）

這種結合的有效性取決于：在凍干和儲存過程中兩種賦形劑的物理形態(tài)；正確的比例以及凍干條件。理想狀態(tài)下，整個過程中糖類應當處于無定形狀態(tài)，起到穩(wěn)定劑的作用；填充劑在干燥之前應當充分結晶，使得樣品具有良好的結構強度，提高關鍵產品溫度，縮短凍干時間。

 Part.1  蔗糖對甘氨酸填充劑結晶的抑制影響

實驗通過將蔗糖和甘氨酸以不同比例（從1:9到9:1）溶解于水中，分別在15℃退火1h 和不進行退火，凍干后樣品通過近紅外光譜測定甘氨酸的結晶度。觀察到當蔗糖：甘氨酸＞4時，甘氨酸失去了其填充劑的功能（Bai et al., J Pharm. Sci. 2004）。

圖2：蔗糖對甘氨酸填充劑功能的影響

Figure plotted from data given in Bai et al., J PHarm. Sci. 2004

 Part.2  海藻糖+甘露醇功能性的相互影響

不同比例的海藻糖+甘露醇溶液進行凍干，二者的比例決定了各自的物理形態(tài)以及其發(fā)揮的功能性（Jena, Suryanarayanan and Aksan, Pharm Res. 2016）。

表2：海藻糖和甘露醇比例對其物理形態(tài)及功能性影響

海藻糖在酸性條件下不會水解，具有較高的玻璃態(tài)轉變溫度，但是具有結晶傾向性。當凍干的條件利于海藻糖無定形形態(tài)存在時，會抑制甘露醇的結晶，相反，當凍干的條件利于甘露醇結晶形態(tài)存在時，會促進海藻糖二水合物的產生，失去其無定形結構，二者相互抑制，因此需要確定理想的一個比例條件，確保各自能發(fā)揮本身應起的作用。從實驗結果來看，當海藻糖和甘露醇比例為1:3時，甘露醇保持其原有的晶體形態(tài)，海藻糖保持其原有的無定形態(tài)，在配方中分別起填充劑和穩(wěn)定劑的功能（Sundaramurthi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. Letters 2010; Sundaramurthiet. al., Pharm. Res. 2010; Sundaramurthi and Suryanarayanan, Pharm. Res. 2010;）。

 Part.3  海藻糖、API（BSA）和甘露醇的相互影響

海藻糖—BSA---甘露醇凍干混合液，海藻糖和BSA的不同比例對海藻糖物理形態(tài)的影響，甘露醇濃度固定在10%W/W，總的固形物含量22%W/W（Jena et al., Int J. Pharm.2019）。

表3：BSA和海藻糖比例對海藻糖物理形態(tài)影響

實驗結果表明

當BSA與海藻糖比例為10:1時，海藻糖能起到良好的穩(wěn)定劑作用。

 Part.4  蔗糖和甘露醇的相互影響

除了抑制作用外，糖可能會改變甘露醇的存在形式，甘露醇有幾種形態(tài)存在，無水甘露醇（α-，β-，δ-）和半水合物-MHH。研究發(fā)現(xiàn)當蔗糖：甘露醇為1:4時，蔗糖會保留無定形態(tài)，甘露醇為結晶態(tài)（部分以MHH形式存在），MHH甘露醇在最終的干燥產品中是不希望存在的，在儲存的過程中，MHH會脫水，釋放水分，水分可能會跟產品中的其他組分進行反應，無定形狀態(tài)的蔗糖吸收水分后會發(fā)生結晶，從而失去了對活性成分的保護功能（Thakral, Sonjeand Suryanarayanan, Int J. Pharm. 2020）。

因此，綜上所述，開發(fā)穩(wěn)定的凍干產品配方，并達到期望的產品質量屬性，需要正確地選擇賦形劑的濃度，包括糖與填充劑的比例，蛋白與糖的比例，并且需要對凍干條件進行優(yōu)化。

 02.API/賦形劑對緩沖液功能性的影響 

緩沖液需要加入到溶液中進行pH的控制。常見的緩沖液包括磷酸鈉緩沖液，磷酸鉀緩沖液，組氨酸緩沖液，tris 緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液，琥珀酸鹽緩沖液等。凍干產品緩沖液的選擇需要考慮蛋白的pKa以及緩沖液組分的結晶傾向，如磷酸鈉緩沖液中，酸性的磷酸二氫一鈉是無定形態(tài)；堿性的磷酸氫二鈉在凍結過程中會結晶成Na?HPO?·12H?O，導致凍結濃縮液的pH降低，失去了緩沖液的功能，因此緩沖液成分的結晶往往是不期望的。

 Part.1  緩沖液，蛋白，糖之間的相互影響

有實驗研究了10mM 磷酸鈉緩沖液，100mM 磷酸鈉緩沖液，含5% w/w的纖維二糖，纖維二糖，在低pH下不會水解，不會結晶（通過在凍結過程中測定其pH值以及使用原位X射線衍射儀對結晶組分進行鑒定）以及100mM 磷酸鉀緩沖液三種緩沖液與纖維二糖，蛋白之間的相互影響，如下表所示（Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel.2020）——

表4：緩沖液、糖及蛋白成分對pH變化的影響

樣品中活性成分蛋白、糖與緩沖液之間具有協(xié)同作用，蛋白可以抑制緩沖液結晶，使其保持無定形狀態(tài)，緩沖液反過來可以維持特定的pH值，增加蛋白的穩(wěn)定性；一定濃度的糖可以抑制緩沖液的結晶，保持其無定形態(tài)，從而維持特定的pH值，提高蛋白穩(wěn)定性。

 Part.2  甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結晶以及pH變化的影響

表5：甘氨酸對磷酸鈉緩沖液結晶以及pH變化的影響

在10 mM緩沖液中，甘氨酸濃度越高，pH值變化越明顯，另外通過用同步X射線衍射法監(jiān)測溶質結晶程度，磷酸鹽緩沖液對甘氨酸結晶具有濃度依賴性抑制作用，20%W/V甘氨酸和50-200mM緩沖液，緩沖液濃度越高，抑制作用越強，并且在-20℃進行退火處理，能夠增強甘氨酸的結晶度。pH的改變能夠引起蛋白凝聚，可以通過降低緩沖液濃度，使用不結晶的緩沖液，通過蛋白，糖來抑制緩沖液結晶，并且某些蛋白本身就具有pH緩沖的功能（Pikal-Cleland et al., J. Pharm. Sci. 2002；Varshney et al., Pharm. Res. 2007；Thorat, Munjal, Geders and Suryanarayanan, J. Control Rel. 2020; Sundarmurathi and Suryanarayanan, J. Phys. Chem. B. 2011; Gokarnet al., J. Pharm. Sci. 2008）。

 03.總結 

凍干配方成分之間具有復雜的相互作用，某些組分可以通過改變其他組分的相行為來影響其功能性，必須正確選擇配方中賦形劑的濃度，使得每種成分能夠維持其理想的物理形態(tài)，發(fā)揮應有的功能性。

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